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細胞凍存和復蘇經(jīng)驗操作流程

更新時間:2017-11-01      點擊次數(shù):3463

細胞凍存和復蘇經(jīng)驗總結

2016/11/29  閱讀(53)

    細胞凍存過程對保持細胞狀態(tài)影響巨大,李記生物結合多年實踐,總結出如下實用的細胞凍存流程。 “慢凍快融” 是細胞凍存及復蘇的基本原則,這對zui大限度的保存細胞活力至關重要。目前細胞凍存多用甘油或二甲基亞砜(DMSO)作為保護劑,這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性;細胞凍存和復蘇時,減少細胞內(nèi)冰晶產(chǎn)生是關鍵。緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外,減少細胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少冰晶對細胞的物理損傷。復蘇細胞采用快速融化的方法可以保證細胞外結晶在很短的時間內(nèi)融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結晶對細胞造成損傷。

細胞凍存操作流程:

1、細胞凍存前12~24h,換新鮮培養(yǎng)基,使細胞一直處于對數(shù)生長期。

2、待細胞長至80%匯合時胰酶消化,用新鮮培養(yǎng)基吹打后制成細胞懸液,1000rpm離心10min。懸浮細胞則直接離心。

3、棄上清,加入凍存液重懸細胞沉淀,調(diào)整細胞濃度為3×106~1×107cells/mL。將細胞懸液分至凍存管內(nèi),每管1~1.5mL,擰緊蓋子。在管壁上做好標記,標明細胞名稱、凍存日期等。(細胞凍存液配方可為胎牛血清:培養(yǎng)基:DMSO=4:6:1或胎牛血清:培養(yǎng)基:DMSO=1:9:1或胎牛血清:DMSO=9:1,可根據(jù)各實驗室實際條件調(diào)整)

4、按下列順序依次降溫:室溫→4℃ 20min →-20℃ 30min →-80℃放一晚→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便,細胞凍存管放入程序降溫盒內(nèi)可直接放入-80℃放一晚,再轉至液氮罐內(nèi)。注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于zui低刻度線;凍存5次后異丙醇需要跟換一次,以免影響凍存效果。

5、細胞凍存后應取出一管復蘇,檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內(nèi)長期保存,為穩(wěn)妥起見可在細胞凍存半年后復蘇培養(yǎng),觀察細胞生長情況,再繼續(xù)凍存。

細胞復蘇操作流程:

1、將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預熱;準備一個15mL無菌的離心管,加入8mL預熱培養(yǎng)基。

2、將凍存細胞從液氮罐中取出,快速放入37℃水浴鍋中復溫(可準備一潔凈的燒杯,裝滿37℃的水,細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi),再逐步轉移到水浴鍋中)。輕輕晃動凍存管,使細胞能在1~2min內(nèi)*解凍,使細胞能盡快通過zui易受損的溫度段(-5~0℃)。注意凍存管管口不能沒入水中,避免引起污染。

3、用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi),將管內(nèi)細胞轉移至準備好的離心管內(nèi),輕輕吹打液體,使細胞均勻分散,降低DMSO濃度,吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次,均轉移至離心管內(nèi)。

4、800rpm離心5min,棄上清,加入新鮮的培養(yǎng)基,吹打制成細胞懸液。

5、將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內(nèi),補加適量的培養(yǎng)基,輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻,放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6、第二天觀察細胞貼壁生長情況,換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng),待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代,細胞活力恢復后才能進行后續(xù)的實驗。

對DMSO不敏感的細胞在復蘇時也可不離心,減少操作步驟,也可降低污染的幾率。將解凍的細胞懸液直接轉移至T25細胞瓶內(nèi),補加新鮮培養(yǎng)基,放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。但培養(yǎng)12~20h后必須換新鮮的培養(yǎng)基,移除死細胞。

 

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