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AB11L234-G418(遺傳霉素)

簡要描述:AB11L234-G418(遺傳霉素),也稱作Geneticin (遺傳霉素)、G418、G 418或者G-418,是一種結(jié)構(gòu)類似于慶大霉素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷類抗生素,來源于Micromonospora rhodorangea,常用于篩選表達(dá)neo基因的真核或原核多克隆或單克隆細(xì)胞。

  • 產(chǎn)品型號:
  • 廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
  • 更新時間:2024-08-07
  • 訪  問  量:1612

詳細(xì)介紹

品牌其他品牌供貨周期現(xiàn)貨
應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè),制藥

AB11L234-G418(遺傳霉素),也稱作Geneticin (遺傳霉素)、G418、G 418或者G-418,是一種結(jié)構(gòu)類似于慶大霉素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷類抗生素,來源于Micromonospora rhodorangea,常用于篩選表達(dá)neo基因的真核或原核多克隆或單克隆細(xì)胞。

G418不僅用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選,也用于穩(wěn)定細(xì)胞株的維持。本產(chǎn)品的50mg/ml包裝經(jīng)過過濾除菌,可以直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。

在細(xì)菌、酵母、原生動物、蠕蟲、高等植物和哺乳動物中,遺傳霉素通過抑制蛋白合成而抑制或殺死細(xì)胞。其作用機(jī)制為遺傳霉素能夠與70S和80S核糖體結(jié)合,從而阻斷肽鏈延伸,干擾蛋白合成。其抗性基因(主要為neo基因)位于轉(zhuǎn)座子Tn601 (903)或Tn5(來源于細(xì)菌),可以在真核細(xì)胞中表達(dá)。通過基因重組技術(shù)將這些抗性基因?qū)爰?xì)胞,使細(xì)胞表達(dá)抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase, APH(3)II),從而獲得對G418的耐藥性,用來篩選和維持培養(yǎng)攜帶抗性基因的原核或者真核細(xì)胞。

哺乳動物細(xì)胞中,當(dāng)抗性基因neo被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組后 ,編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase, APH(3)II)。此酶通過共價修飾G418的氨基或羥基功能,抑制抗生素-核糖體間的相互作用,從而使得抗生素失活。這一特性賦予細(xì)胞產(chǎn)生抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選實驗時,需要建立劑量反應(yīng)曲線(dose-response curve or kill curve)確定殺死無抗性細(xì)胞的zui低有效濃度。

植物細(xì)胞中,通過轉(zhuǎn)染攜帶nptII基因的抗性質(zhì)粒孵育其抗性。nptII基因也能編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶,這個酶使得多種抗生素喪失活性,包括 G418,卡那霉素和巴龍霉素。

G 418與新霉素同為氨基糖苷類抗生素,都可被Neo基因產(chǎn)物失活,因此都可以用于篩選攜帶Neo抗性基因的細(xì)胞,新霉素篩選的細(xì)胞都可以用G418替代。


訂購信息


產(chǎn)品名稱

貨號

規(guī)格

價格

G418(遺傳霉素)

AB11L234

1 g

550




運(yùn)輸與保存



常溫運(yùn)輸。4℃保存,有效期36個月。


技術(shù)參數(shù)


1.CAS:108321-42-2

2.分子式:C20H40N4O10·2H2SO4  

4.分子量:692.71

5.純度:~98%
6.結(jié)構(gòu)式:

AB11L234-G418(遺傳霉素)使用方法


1.G418儲存液的配制(50mg/ml,活性濃度)
(1)活力單位的換算
  根據(jù)此公式進(jìn)行換算:(1000/A0)×A1=A2,其中A0是G418的活力值(Potency),因批次而異,具體見瓶子的標(biāo)簽。A1是想配制的活性G418濃度。A2是實際稱重的粉末與體積比濃度。
  比如若所用批次的G418 活力值為:750µg/mg,要配制50mg/ml的G418活性濃度,則實際要配制的粉末濃度為1000/750×50mg/ml=66.33mg/ml。
  如果配制10ml的G418儲存液(活性濃度,50mg/ml),則需要稱取663.3mg粉末。
(2)除菌和保存
  根據(jù)上述換算得到的實際粉末稱重量,加入10ml無菌去離子水使其*溶解。
  先用5ml無菌去離子水預(yù)濕潤0.22μm針頭式過濾器,除盡水。之后使用此濾器過濾,除菌后分裝成單次使用的小量(如1ml)放到-20℃凍存,1年穩(wěn)定。
【注】:不要對混濁的溶液進(jìn)行過濾,因為混濁的溶液意味著藥物未*溶解,過濾過程中會造成藥物損失,降低活性;不建議使用液體培養(yǎng)基,NaCl,磷酸鹽溶液或者有機(jī)溶劑來制備儲存液;配制G418溶液時,一定要根據(jù)相應(yīng)批次G418標(biāo)注的活力值(potency)來進(jìn)行換算,從而得到需要活性濃度的儲存液以及工作液。
2.建議使用濃度
  一般來說,剛開始篩選轉(zhuǎn)化子需要高濃度的G418,并用一個較低濃度的G418維持培養(yǎng)。生長條件,細(xì)胞類型和其它的環(huán)境因素都可能影響G418的用量,因此第一次使用的實驗體系建議通過劑量反應(yīng)性曲線(dose-response curve or kill curve),來確定最佳篩選濃度。
  通常情況,哺乳動物細(xì)胞篩選范圍200-2000μg/ml;植物細(xì)胞:10-100μg/ml;酵母細(xì)胞:500-1000μg/ml。

表1.部分哺乳動物細(xì)胞的推薦工作濃度表。

細(xì)胞名稱

細(xì)胞類型

濃度

B16

Mouse melanocytes

400-1000μg/ml

CHO

Chinese hamster ovarian cells

400-800μgμg/ml

Hela

Human uterine cells

200-400μg/ml

HEK293

Human embryonic kidney cells

200-500μg/ml

THP-1

Human monocytes

250μg/ml

 

3.遺傳霉素劑量反應(yīng)曲線的建立
  遺傳霉素的有效篩選濃度跟細(xì)胞類型、生長狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝及細(xì)胞所處細(xì)胞周期等因素相關(guān)。為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株,確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的遺傳霉素zui低濃度非常重要,對于初次使用的細(xì)胞,一般需要通過實驗來確定適合自身實驗體系的劑量反應(yīng)曲線(dose-response curve or kill curve),曲線建立時至少應(yīng)設(shè)置6個遺傳霉素濃度。遺傳霉素處理分裂期的細(xì)胞時活性*,因此在添加遺傳霉素之前需要先將細(xì)胞培養(yǎng)一段時間。
(1)第一天:未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上,37℃,CO2培養(yǎng)過夜。
注:對于需要更高密度來檢測活力的細(xì)胞,可增加接種量。
(2)根據(jù)細(xì)胞類型,設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動物細(xì)胞為例,可設(shè)定0、50、100、200、400、800、1000μg/ml。
(3)第二天:去除舊的培養(yǎng)基,換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度遺傳霉素的培養(yǎng)基。每個濃度做三個平行孔。更換培養(yǎng)基后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(4)接下來每3-4 d更換新的含藥物培養(yǎng)基。
(5)按照固定的周期(如每2 d)進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)(通常是7-10 d)內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的zui低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。
4.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選
(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,將細(xì)胞置于含有適當(dāng)濃度遺傳霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng),此為處理組。
(2)【注】:當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時,抗生素作用zui明顯。當(dāng)細(xì)胞過于密集,抗生素產(chǎn)生的效力會明顯下降,所以細(xì)胞的密度最好不超過25%。建議同時做一個正常細(xì)胞的對照組。轉(zhuǎn)染或感染48 h后,如果細(xì)胞過密也可以消化后重新接種細(xì)胞,培養(yǎng)過夜后即可進(jìn)行遺傳霉素篩選。每隔3-4 d更換含有遺傳霉素的培養(yǎng)液。

(3)篩選7 d后觀察并評估細(xì)胞克隆(集落)的形成情況。對照組正常細(xì)胞應(yīng)該100%死亡,處理組中存活的細(xì)胞為表達(dá)neo基因的細(xì)胞。根據(jù)宿主細(xì)胞種類和轉(zhuǎn)染/篩選效率不同,集落的形成可能需要一周或者更多的時間。
(4)克隆形成后,挑取并轉(zhuǎn)移5-10個抗性克隆于35mm細(xì)胞培養(yǎng)板,繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7 d。
(5)之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。


注意事項


1.本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實驗研究使用,不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.用于細(xì)胞實驗,溶解后,須用一次性針頭濾器過濾除菌。

3.本產(chǎn)品不可高壓滅菌。

4.G418不要和其它抗生素/抗真菌劑(如青霉素/鏈霉素)共同使用,因為它們是G418的競爭性抑制劑。其它的抗生素也會產(chǎn)生交叉活性。

5.G418加入培養(yǎng)體系中,未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有可能不會被殺死,原因在于藥物濃度過低,或者細(xì)胞密度過高。另外,快速分裂的細(xì)胞相對于緩慢增殖細(xì)胞,更容易被殺死。對照細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染)可能在添加抗生素5-7 d后才能被殺死,轉(zhuǎn)染細(xì)胞(抗性克隆子)的克隆需要10-14 d形成。

6.即使加入有效劑量的G418,細(xì)胞可能會繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2 d后才變得明顯。

7.本產(chǎn)品可能對人體有一定的毒害作用,請注意適當(dāng)防護(hù),以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

8.為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

9.抗生素不穩(wěn)定,請在有效期內(nèi)盡快使用。

10.以上數(shù)據(jù)均來自公開文獻(xiàn), 李記生物暫未本產(chǎn)品進(jìn)行獨立驗證, 僅供參考。


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